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mdbioproducts常見實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用程序的故障排除
洗滌技巧：
確保移液器的每個(gè)尖頭都正確分配或噴射瓶有足夠的壓力。清空孔中的內(nèi)容物并用指示的洗滌緩沖液體積填充孔。倒出孔，倒置并在干凈的紙巾上吸干。如插入所示重復(fù)此過程。最后一次傾析后，倒置去除任何剩余的洗滌緩沖液，并將其吸干在干凈的紙巾上。不要讓孔靜置，按照插圖中的指示進(jìn)行下一步。注意：如果在傾析時(shí)條帶變得松散，則在清洗和在干凈的水槽中潷析之前對(duì)條帶進(jìn)行編號(hào)非常有用。
確保有適當(dāng)?shù)恼婵展?yīng)。檢查所有插管或插腳是否正確分配和抽吸。通過抽吸或傾析清空孔。將每個(gè)孔填充到插入物中指示的適當(dāng)體積。*吸出孔。去除緩沖液后，讓抽吸裝置留在孔中，不要過度抽吸孔。如插入物所示重復(fù)此過程，不要讓孔在最后一次抽吸后保持干燥。
移液技術(shù)：
確保您使用的移液器已校準(zhǔn)，并且移液器吸頭正確且牢固地固定在移液器上。將移液器設(shè)置到所需的體積并用樣品或試劑預(yù)沖洗。緩慢向上吸取試劑，使移液器緩慢返回向上位置。稍等片刻，讓試劑在吸頭中達(dá)到體積平衡。將試劑緩慢分配到第一次停止，然后輕輕分配到第二次停止。將移液器保持在此位置，直到將其從儲(chǔ)液器或孔中取出，以避免將試劑吸回。當(dāng)您取下移液器時(shí)，將吸頭向上拉到容器或孔的一側(cè)，以釋放可能在吸頭外側(cè)的任何液體。
ELISA 故障排除
許多因素會(huì)影響 ELISA 的性能。
IHC 故障排除
無染色
| 問題 | 可能的解決方案） | |
| 一抗和二抗可能不匹配。 | 建議二抗針對(duì)產(chǎn)生一抗的物種（例如，如果一抗是在小鼠中產(chǎn)生的，則使用抗小鼠二抗）。 | |
| 該抗體可能不適用于以天然（非變性）形式顯示蛋白質(zhì)的 IHC 程序。 | 在非變性和變性蛋白質(zhì)印跡上測(cè)試抗體，以確保抗體識(shí)別非變性抗原。 | |
| 二抗未避光保存。 | 建議避免將二抗暴露在光線下。 | |
| 沒有足夠的一抗與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。 | 減少抗體稀釋。 在 4°C 下孵育更長(zhǎng)時(shí)間。 | |
| 感興趣的蛋白質(zhì)并不大量存在于組織中。 | 運(yùn)行陽性對(duì)照。 利用放大步驟可以幫助放大信號(hào)。 使用較低稀釋度的一抗。 | |
| 目標(biāo)蛋白是核蛋白，抗體不能穿透細(xì)胞核。 | 為了促進(jìn)細(xì)胞核的滲透，在封閉緩沖液和抗體稀釋緩沖液中加入透化劑。 | |
| 脫蠟可能不夠 | 將切片脫蠟時(shí)間更長(zhǎng)。 使用新鮮制備的二甲苯。 | |
| 福爾馬林和多聚甲醛等固定劑可能會(huì)改變抗體識(shí)別的表位。 | 使用抗原修復(fù)方法揭露表位。 修復(fù)時(shí)間更短。 | |
| PBS 緩沖液可能被細(xì)菌污染，這些細(xì)菌已經(jīng)破壞了目標(biāo)蛋白質(zhì)。 | 在 PBS 抗體儲(chǔ)存緩沖液中使用防腐劑，如 0.01% 疊氮化物。 使用新鮮的無菌 PBS。 |
高背景
| 問題 | 可能的解決方案） | |
| 非特異性結(jié)合的阻斷可能是不夠的。 | 將切片的封閉潛伏期延長(zhǎng)至 30 分鐘，將細(xì)胞培養(yǎng)延長(zhǎng)至 1 小時(shí)。使用封閉劑，例如 10% 正常血清用于切片，1-5% BSA 用于細(xì)胞培養(yǎng)。 | |
| 一抗?jié)舛瓤赡芴摺?/td> | 將抗體滴定至更佳濃度，使用更多稀釋液孵育更長(zhǎng)時(shí)間。這將提供更慢但更具體的綁定。 | |
| 二抗可能非特異性結(jié)合。 | 在沒有一抗的情況下運(yùn)行二級(jí)對(duì)照。 | |
| 孵化溫度可能太高。 | 在 4°C 下孵育組織切片或細(xì)胞。 | |
| 組織未充分洗滌。 | 在所有步驟之間用 PBS *清洗 | |
| 內(nèi)源性過氧化物酶是有活性的。 | 使用酶抑制劑，如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。 | |
| 福爾馬林和多聚甲醛等固定劑太強(qiáng)，可能已經(jīng)改變了抗體識(shí)別的表位。 | 改變抗原修復(fù)方法。 減少抗原暴露溶液的孵育時(shí)間。 | |
| 應(yīng)用了過多的基材。 | 減少底物孵育時(shí)間。 | |
| 色原與細(xì)胞中存在的 PBS 發(fā)生反應(yīng)。 | 在與底物一起孵育之前，使用 Tris 緩沖液清洗切片。 | |
| 透化已經(jīng)損壞了膜并去除了膜蛋白。 | 從緩沖液中去除通透劑。 |
非特異性染色
| 問題 | 可能的解決方案） | |
| 一抗或二抗的濃度可能太高。嘗試降低抗體濃度和/或潛伏期。 | 將信號(hào)強(qiáng)度與不表達(dá)目標(biāo)的細(xì)胞進(jìn)行比較。 | |
| 一抗是針對(duì)與染色組織相同的物種產(chǎn)生的（例如在大鼠組織上測(cè)試的大鼠一抗）。 | 當(dāng)應(yīng)用二抗時(shí)，它會(huì)與所有組織結(jié)合，因?yàn)樗彩轻槍?duì)該物種產(chǎn)生的。使用針對(duì)與您的組織不同的物種產(chǎn)生的一抗/二抗。 | |
| 內(nèi)源性過氧化物酶是有活性的。 | 使用酶抑制劑，如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。 | |
| 切片/細(xì)胞已變干。 | 將組織切片和細(xì)胞保持在高濕度下，不要讓它們變干。 |
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